月季(Rosa chinensis)因其丰富的色彩及多样的花型，具有较高的观赏价值，故而调控其花色成为了月季品种改良、增加其商业价值的重要目标之一。变色月季以其花色随着花开放过程发生明显变化的特点，对其变色机理进行研究可以为月季的花色育种提供重要的理论依据。

‘光谱’(Spectra)是变色月季中具有代表性的品种，花开放过程中颜色变化较为明显，为典型黄底色变色系月季中应用较为广泛的一个品种(曹蕾, 2009)，通过对其花色变化机理进行研究可以为月季花色育种提供理论依据。

花青素是影响植物花色的重要化合物，它在植物中常常以糖苷形式(花色素苷)存在于植物细胞的液泡中，是构成从红色到紫色、蓝色的主要物质。花青素含量的升高和降低都可以改变花的颜色(潘耕耘和邱其伟, 2006, 思茅师范高等专科学校学报, 22(3): 19-22)。有研究表明，花青素含量的迅速变化是引起部分月季品种变色的主要原因(曹蕾, 2009)。对月季花色育种的研究离不开对花青素合成和调控机理的研究。

花青素的合成受多种环境和发育信号的调控，其中光是最主要的外部调节因子(胡可等, 2010)。朱新贵等在对玫瑰茄悬浮细胞合成花青素的研究中表明，光质、光强均能影响花青苷的合成量和组成(朱新贵和郭勇, 1998; 朱新贵等, 1999)；杜雄明(1992)对棉花的研究表明，只要累计达到6 h的临界光照时间，棉花的花就能够发生变色，变色与液泡pH关系不大；Dong等(1998)以苹果花为材料，研究了光对花色形成的影响，结果表明阻断光照后，花不能正常着色，这是由于黑暗下花青素合成途径中DFR和ANS基因的表达受到了强烈的抑制。针对变色月季中花青素与花色变化关系的研究尚不多见，通过测定不同光照条件下‘光谱’花开放过程中花青素含量的变化情况，将可为探明月季变色机理提供理论依据。

花青素含量受环境因素的影响，但最终是由植物体内相关基因调控所决定的。通过对不同环境条件下基因表达情况的研究，可以阐明花青素含量变化的分子机理。有研究表明在花青素合成过程中，查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是合成途径中的第一种关键酶；二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol- 4-reductase, DFR)负责将3种二氢黄酮醇还原为无色花青素(赵云鹏等, 2003)。有研究表明，光促进活体与离体条件下非洲菊花色素苷积累与CHS、DFR基因表达(Meng et al., 2004)；而光仅在矮牵牛花发育的早期诱导基因表达，在花发育晚期，光的影响显著下降(Weiss, 2000; Katz and Weiss, 2002)。可见，光照首先影响CHS、DFR基因表达情况，而进一步影响花青素的合成。关于月季中CHS、DFR基因的表达情况鲜见报道，为探明月季变色的分子机理，有必要对其CHS、DFR基因在不同光照条件下的表达量进行测定。

本研究拟通过测定不同光照条件下‘光谱’花开放过程中花中花青素含量变化情况，及CHS和DFR基因的表达变化，探讨‘光谱’花色变化的调控机制，以期为月季花色育种提供理论依据。

1结果与分析
1.1‘光谱’变色过程
光谱’花色变色过程如图1所示，L组变色现象是由蕾期的外层花冠开始的，随着花的开放，花瓣外翻，光照时间的延长且受光面积的增大，变色范围也逐渐扩大。至末花期时整个花冠几乎全部变为红色，说明光照很大程度上影响着‘光谱’的花冠着色。而在花蕾未显色时对月季品种‘光谱’进行遮光处理的S组花蕾期、初花期、盛花期、末花期均无红色出现，说明花冠接受光照是月季品种‘光谱’花瓣变红的必要条件。对花色RHSCC值得测定结果(表1)表明，随着花冠见光时长的增加，L组花瓣红色部分红色色调逐渐加深，可见变色程度与光照时间存在一定程度的正相关。

两种处理下，花的开放过程较为一致，开放程度和花的长势均无明显差异，说明除花色外，光照并未对花的生长和开放过程中的其他表型造成影响。

1.2花青素含量变化
不同的光照条件下花瓣中花青素的含量变化如图2所示，L组花瓣中花青素的含量随着花朵开放呈明显上升趋势，末花期的花青素含量已经达到23.58 mg/g·FW，为花蕾期的17.3倍，说明随着花冠见光时间增长，花青素积累，含量增加；而S组花瓣中花青素含量则呈逐渐减少的趋势，仅在花蕾期与L组无显著差异(p>0.05)，而初花期、盛花期和末花期花青素含量均显著低于L组(p<0.05)，到末花期时，仅为L组花瓣花青素含量的3.0%，表明遮光阻碍了花青素的合成。

上述结果表明光照诱导花青素含量增加，遮光阻碍花青素含量增加，而与之对应的花冠颜色变化分别为红色加深和无红色出现，说明‘光谱’花冠逐渐变红是由花青素含量变化引起的。

1.3基因表达量变化
CHS、DFR基因的相对表达量结果(图3)表明，L组‘光谱’中的CHS基因在初花期时相对表达量最多，然后逐渐下降，至末花期时基本不表达，表达量仅为初花期的3.5%；DFR基因的表达量逐渐增加，至盛花期时达到最高，末花期表达量急剧下降，相对表达量只有0.22，为盛花期的12.4%。另外，CHS基因的表达量在初花期达到最大，而DFR基因则在盛花期表达量最多，说明DFR基因的表达高峰期在时间上滞后于CHS基因，可能是由于二者在调控途径中的顺次表达所致。

S组CHS基因表达量呈现逐渐降低的趋势，自花蕾期开始逐渐降低，且在初花期和盛花期均显著低于(P<0.05) L组，分别为L组的15.0%和17.5%；与CHS基因表达量变化相似，遮光条件下，DFR表达量在花蕾期最高，呈逐渐减少的趋势，表达量在初花期和盛花期也均显著低于(P<0.05) L组，分别为L组的48.8%和55%。

上述结果表明，遮光后CHS和DFR基因均呈现表达量下降的趋势，说明遮光会明显抑制基因CHS和DFR的表达。正常光照条件下，CHS和DFR基因均在初花期和盛花期表达量最高。与花青素含量变化比较可以发现，CHS和DFR基因表达被抑制的情况下，花青素含量一直维持在较低水平，而正常情况下，CHS和DFR基因表达量随花的开放不断升高，同时花瓣中花青素含量也不断升高，这说明‘光谱’中CHS和DFR基因的表达量的增加可以促进花青素的合成。

综合花色表型变化、花青素含量变化与基因表达量变化来看，光照条件下CHS、DFR基因顺次表达，花青素含量明显增多，花冠由黄色明显变为红色；遮光条件下，CHS、DFR基因的表达受到抑制，花青素的合成受阻，花冠不变红色，仍然呈黄色，研究结果说明，光照促进了CHS和DFR基因的表达，从而导致花冠中花青素的含量增加，花冠颜色变红。证明了光照条件下花冠的变色调控途径为：花色由花青素含量决定，而花青素的含量受到CHS和DFR基因的调控，同时上述两个基因的表达量受光照条件的影响。

2讨论
2.1花青素含量变化
光照是影响花着色的重要环境因子。本研究中，遮光条件下‘光谱’的花青素不能正常合成，无变红现象，花青素总量减少，这说明‘光谱’的变色具有光依赖性，在苹果花的研究中也表明，阻断光照后，花不能正常着色(Dong et al., 1998)，与本研究的实验结果一致。李崇晖等(2008)对在迎红杜鹃在开花过程中的花色变化的研究中指出，随着花的开放，由于成熟和老化的花瓣中色素合成量减少，迎红杜鹃花瓣中的花青素总量减少，花色变浅，而与迎红杜鹃不同，本试验中，变色月季品种受光照影响，总花青素含量大量增加，颜色由黄色变为红色，可能是由于不同作物中不同的转录因子与相关结构基因作用造成光对花青素含量影响不同。孟祥春等(2007)对非洲菊花色素苷积累的研究结果也表明阻断光照后，花不能正常着色。

2.2基因表达量变化
本研究表明，光照诱导CHS和DFR基因的表达，而遮光会明显抑制基因CHS和DFR的表达，验证了本研究中花青素含量变化的结论，并与孟祥春等对光和糖对非洲菊花青素积累及CHS、DFR基因表达的影响的研究结果一致(赵焕英和包金风, 2007, 中国组织化学与细胞化学杂志, 16(4): 492-497)。闫海芳(2003)在对光环境影响花青素合成途径中相关基因表达的机制的研究中指出，津田芜菁是光敏感的完全依光型表达，即有光诱导时相关基因表达，遮光时则不表达；而本研究表明，月季‘光谱’在遮光时相关基因表达量虽减少，但仍有一定的表达量，表现出光敏感的部分依光型表达，与周波(2004)对光照影响草莓花青素合成相关基因表达的研究结果一致。

本研究中，DFR基因的表达滞后于CHS基因，可能是由于CHS基因调控的查尔酮合酶在第一步反应中催化花青素生物合成，在初花期之后CHS基因的表达量逐渐降低，查尔酮合酶逐渐分解，DFR基因调控的二氢黄酮醇-4-还原酶作用于花青素生物合成途径的中后期，选择催化3种二氢黄酮醇形成相应的花青素、花翠素和花葵素，这证实了二者在类黄酮合成途径中顺次表达(Rosati and Simoneau, 2006)；遮光条件下基因CHS与DFR的表达量远低于光照条件，说明遮光会明显抑制基因CHS和DFR的表达，验证了遮光条件下花青素合成受阻的结果。

有关类黄酮生物合成途径的研究中指出，在类黄酮的生物合成途径中PAL与ANS基因对花青素的积累也有重要的作用(Rosati and Simoneau, 2006)，鉴于目前月季的这2个基因没有明确的序列，本研究未对其进行测定，通过克隆得到PAL与ANS基因，再利用qRT-PCR技术研究2个基因在整个花开放过程中正常光照和遮光处理下的表达量变化，可以进一步明确光照对变色月季花青素含量变化的影响机理；此外，本研究只考虑到类黄酮生物合成途径中的其中一种代谢产物花青素在花色变化中的作用，对代谢途径中除花青素外其他中间产物进行含量分析可为影响花色变化的主要物质提供更多的证据。

3材料与方法
3.1供试材料
供试材料为变色月季品种‘光谱’，种植于北京昌卉景观园林有限公司，采样时间为2011年5月上旬至5月末。选取8株生长环境一致、长势一致的植株上24个未显色花蕾，随机分为S组、L组两组，S组用双层不透光苹果纸袋进行遮光处理，L组正常光照。分别取在两组处理下花蕾期、初花期、盛花期和末花期4个时期的‘光谱’花冠，摘取每个处理的全部花瓣，液氮研磨后存于-70℃的冰箱中备用,测定花瓣中总花青素含量，并采用qRT-PCR技术测定CHS和DFR基因的RNA表达量，从而确定相关基因及代谢产物对花色变化的影响。

3.2花色测定
采用英国皇家园艺学会比色卡(royal horticultural society colour chart, RHSCC)对S组新鲜花瓣中间部分、L组新鲜花瓣的边缘部分以及花瓣近基部部分花色进行对比。

3.3总花青素含量的测定
称取0.100 0 g冷冻花瓣放入具塞试管中，加入10 mL含有1%浓盐酸(v/v)的甲醇溶液在暗处浸提48 h (白新祥, 2007)，用Unic公司生产的UV2000型紫外可见分光光度计在在500~600 nm处扫描，扫描间隔为2 nm，石英杯光径为1.0 cm (赵昶灵, 2005)，得最大吸收波长为548 nm，以每克鲜重的A548表示花青素含量。单位为OD/g·FW (孟祥春等, 2007)。

3.4基因表达量的测定
用复杂植物总RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳。用DNaseⅠ将RNA进行消化处理，将消化处理后的RNA用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录。引物设计以月季看家基因16sRNA为内参基因，在GeneBank里查到3个基因的基因序列，基因登录号分别为：HQ423171.1、AY780885.1和AB370121.1。根据提供序列设计引物(表2)。

用Roche480型荧光定量PCR仪，用UltraSYBR Mixture (with Rox)进行扩增。扩增程序为：95℃ 10 min，(95℃ 15 s, 60℃ 60 s)×40个循环。根据qRT-PCR原始检测结果，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析，即F=2^(i-t) (i为对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值；t为待见样品目的基因平均Ct值-待见样品看家基因平均Ct值)。

以L组初花期样本为对照样本，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异。

作者贡献
骆菁菁是本研究的实验设计和实验研究的执行人；骆菁菁，李虹及柏斌斌完成数据分析，论文初稿的写作；俞红强参与实验设计，试验结果分析；游捷是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部948重点项目(2008-G3)和农业部行业科技项目(200903020)共同资助。感谢北京市昌卉景观园林有限责任公司为本研究提供试验地与供试材料。

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